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Técnicas de coloración, histoquímica e impregnación

En esta sección pueden encontrar ejemplos de preparados histológicos que utilizan distintas técnicas de coloración utilizadas frecuentemente en el laboratorio de histología.


Hematoxilinas y Eosina


Hematoxilina-Eosina

Esta es la técnica más frecuentemente usada en histología animal y en la rutina anatomopatológica. El colorante básico, la hematoxilina, colorea las estructuras ácidas de azul purpúreo. Núcleos, ribosomas y retículo endoplásmico rugoso tienen una gran afinidad por este colorante debido a su alto contenido de ADN y ARN, respectivamente. Por el contrario, la eosina es un colorante ácido que colorea estructuras básicas de rojo o rosa. La mayoría de las proteínas citoplásmicas son básicas y por ello el citoplasma generalmente se colorea de rosado. En general, cuando la técnica de tinción de H-E es aplicada a células animales, los núcleos se colorean de azul y el citoplasma toma un color rosa o rojo. La hematoxilina es un colorante natural, cuyo producto de oxidación (la hemateína) cumple la función de colorante. La hemateína por sí sola tiene poca afinidad por los tejidos, por tanto debe utilizarse con un mordiente. De acuerdo al mordiente tendremos las distintas hematoxilinas. Las hematoxilinas más utilizadas para la coloración hematoxilina-eosina suelen utilizar como mordiente sales de aluminio, como es el caso de la hematoxilina de Mayer, de Harris o de Ehrlich.




Hematoxilina férrica y hematoxilina fosfotúngstica

La hematoxilina es un colorante natural, cuyo producto de oxidación (la hemateína) cumple la función de colorante. La hemateína por sí sola tiene poca afinidad por los tejidos, por tanto debe utilizarse con un mordiente. De acuerdo al mordiente tendremos las distintas hematoxilinas, entre ellas la férrica y la fosfotúngstica.

Hematoxilina férrica de Weigert

Es una coloración muy estable, que resulta útil para estudiar detalles celulares finos pues brinda una coloración nítida y bien diferenciada. En este caso se usan como mordientes sales de hierro, las que actúan a la vez como agentes oxidantes. la laca férrica que forman estas hematoxilinas presenta color negro o azul-negro.

Hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory

Esta técnica se utiliza para el estudio del tejido muscular y tejido conjuntivo, en particular para observar estrías musculares y fibras conjuntivas. En este caso el mordiente utilizado es el ácido fosfotúngstico. Resultados: cromatina, eritrocitos y cilias se colorean azul oscuro, las estriaciones musculares azul casi negro y los citoplasmas se colorean rosa pálido.




Técnicas para el estudio del tejido conjuntivo


Técnicas tricrómicas

Las técnicas tricrómicas se utilizan por lo general para detectar y diferenciar colágeno y músculo. Implican el uso de tres colorantes, uno generalmente nuclear y otros dos citoplasmáticos y/o extracelulares. Permiten observar detalles que con las técnicas corrientes no se distinguen y dan colores intensos con contrastes muy marcados.

Tricrómico de Cajal-Gallego

Es una técnica destinada fundamentalmente a la demostración diferencial y selectiva de las fibras colágenas y del músculo. Para los núcleos y otras estructuras basófilas se utiliza una coloración nuclear, la fucsina básica (color magenta) y como colorante de fondo el Índigo Carmín asociado al ácido pícrico. El colágeno adquiere color azul claro dada la alta permeabilidad del mismo y a que el índigo carmín es el colorante de mayor tamaño molecular de los utilizados. Los citoplasmas se colorean de amarillo por el ácido pícrico, con un tamaño molecular relativo pequeño que le permite penetrar en estas estructuras poco permeables. El músculo, de permeabilidad intermedia toma ambos colorantes visualizándose verde.
En el caso del tejido nervioso, los somas neuronales suelen colorearse de color magenta por la fucsina básica y las zonas ricas en fibras nerviosas (sustancia blanca, nervios, etc.) adquieren una tonalidad verde-azulado pálido.




Técnica de Van Gieson

Esta coloración constituye otra técnica de coloración destinada fundamentalmente a la demostración diferencial de fibras colágenas y del músculo. Está compuesta por 3 colorantes: Hematoxilina de Weigert para los núcleos, ácido pícrico para los citoplasmas y fucsina ácida para el colágeno. Las pequeñas moléculas de ácido pícrico penetran todos los tejidos pero son retenidas principalmente en glóbulos rojos y músculo. Las grandes moléculas de fucsina desplazan al ácido pícrico de las fibras de colágeno por sus grandes poros que permiten su entrada. Con esta técnica se observan los núcleos de azul oscuro, las fibras de colágeno en magenta intenso y el músculo, glóbulos rojos y tejido nervioso en tonalidades de amarillo.




Azán de Heidenhain

Esta coloración constituye otra técnica de coloración tricrómica destinada fundamentalmente a la demostración diferencial de fibras colágenas y del músculo. Para los núcleos se utiliza una coloración nuclear, el hemalumbre y como colorante de fondo el azul de Heidenhain asociado al picro-orange G. Los núcleos aparecen de color violeta rojizo, el colágeno de azul, el músculo de un color pardo amarillento y los eritrocitos de color amarillento. Esta coloración resalta muy bien la estriación del músculo y los discos intercalares del miocardio.




Tricrómico de Masson

Esta técnica se utiliza para el estudio del tejido muscular y tejido conjuntivo, en particular para observar estrías musculares y fibras conjuntivas. En este caso el mordiente utilizado es el ácido fosfotúngstico. Resultados: cromatina, eritrocitos y cilias se colorean azul oscuro, las estriaciones musculares azul casi negro y los citoplasmas se colorean rosa pálido.




Técnicas para marcar fibras

Existen técnicas que permiten marcar de forma específica fibras del tejido conjuntivo.


Doble impregnación argéntica

Esta técnica, a diferencia de las coloraciones, consiste en el depósito selectivo de sales de metales pesados (plata, oro, osmio, etc.) sobre ciertas células y estructuras tisulares (impregnación). Existen gran número de técnicas argénticas, debiéndose seleccionar la más específica para la estructura que deseamos estudiar. La naturaleza y fundamento de estas técnicas se desconoce al igual del por qué algunas estructuras se impregnan y otras no, considerándosela "técnicas empíricas". Estas técnicas son utilizadas frecuentemente para reconocer estructuras nerviosas. También se utilizan para impregnar fibras reticulares del rejido conjuntivo observándose negras o azules. Los núcleos celulares pueden contrastarse con hematoxilina o con rojo neutro.




Orceína

La orceína es un colorante natural, específico para fibras elásticas. En esta coloración el tipo de unión predominante entre tejido y colorante son las fuerzas de Van der Waals, responsables de la tinción. Las fibras elásticas las veremos entre bordeaux y castaño oscuro, mientras que las demás estructuras tisulares se tiñen de color marrón pálido.




Resorcina fucsina de Weigert

La Resorcina fucsina es un colorantes para fibras elásticas. Las fibras elásticas coloreadas con resorcina fucsina de Weigert se ven de color violáceo o azuladas.




Técnicas para evidenciar carbohidratos

Existen diversas técnicas que permiten evidenciar distintas clases de carbohidratos en los preparados histológicos.


Ácido Peryódico de Schiff (PAS)

Las técnicas de coloración que marcan específicamente componentes de las células y los tejidos en base a una reacción química definida son denominadas técnicas histoquímicas. Estas técnicas son de gran valor para comprender la estructura y la función de la célula y el tejido y para hacer diagnósticos. La reacción de PAS colorea carbohidratos complejos de un color rojo oscuro, descrito tradicionalmente como magenta. Se utiliza para demostrar glucógeno y glicoproteínas como las mucinas y componentes de la membrana basal que subyace a los epitelios. Las estructuras que se colorean con esta técnica se denominan PAS positivas. Usualmente se utiliza como coloración de contraste la hematoxilina.




Alcian blue

Alcian Blue es un colorante catiónico de gran tamaño molecular, inicialmente usado para teñir fibras textiles. Se utiliza para evidenciar glucoconjugados ácidos, como las mucinas ácidas (sialomucinas y sulfomucinas), así como proteoglicanos (y GAGs). El mecanismo exacto de tinción se desconoce, pero se cree que dada su naturaleza catiónica forman uniones electrostáticas con moléculas polianiónicas. El componente tisular es teñido más intensamente si el colorante es usado al pH al cual la mayoría de los grupos reactivos están ionizados (cargados negativamente). Es decir que variando el pH se pueden identificar diferentes glucoconjugados ácidos.




Alcian blue-PAS

Las técnicas de PAS y Alcian Blue (AB) pueden combinarse para diferenciar mucinas neutras de ácidas en los tejidos. AB tiñe sialomucinas, sulfomucinas y proteoglicanos de azul. Las mucinas neutras se tiñen de magenta/rojo por el PAS. Y las células y tejidos que contengan tanto mucinas neutras como ácidas se tiñen con distintas tonalidades de púrpura debido a la unión del AB y la reactividad con el reactivo de Schiff. Esto puede verse en las células caliciformes del intestino delgado que contienen tanto mucinas neutras como sialomucinas.




Lectinas

Las lectinas son proteínas que reconocen y se unen a una secuencia específica de residuos de carbohidratos. Fueron aisladas originalmente en plantas, pero más tarde se han encontrado en todos los tipos de organismos. Presentan dos o más sitios de unión a carbohidratos, mediante los cuales las lectinas pueden unir glicoproteínas (o glicolípidos) de la superficie de varias células y así aglutinarlas. Para la evidenciar su unión a estructuras tisulares pueden conjugarse a fluorocromos, biotina o enzimas.




Técnicas para el estudio del hueso


Técnica de desgaste para hueso seco

En esta técnica se toma un trozo de hueso, previamente desecado y se lo raspa contra una piedra de afilar especial, hasta que el grosor sea tal que pueda ser atravesado por el haz de luz del microscopio. Este preparado no se colorea, se coloca la lámina ósea directamente sobre el portaobjeto, y luego se agrega bálsamo de Canadá y el cubreobjeto. En estos preparados, debido a la desecación, no se observan células ni elementos orgánicos, únicamente se aprecian elementos inorgánicos y cavidades.




Técnica de Schmorl

La tinción de Schmorl es utilizada para la visualización de la matriz, las lagunas y los canículos óseos del hueso. Es realizada por dos agentes colorantes: la tianina amoniacal y el ácido pícrico saturado; la tianina precipita en las lagunas y canalículos, mientras que el pícrico forma picratos en la matriz ósea. El resultado es que lagunas y canalículos se tiñen de marrón oscuro a negro, y la matriz de amarillo a marrón claro.




Técnicas para el estudio de la sangre


May-Grünwald Giemsa (MGG)

Esta es una técnica de rutina para el examen de la sangre en los laboratorios de hematología clínica y permite visualizar detalles a nivel citoplasmático (granulaciones) y nuclear (cromatina y nucléolo) que sirven para reconocer y clasificar a las células sanguíneas y sus precursores de la médula ósea. Es una variante del método de Romanovsky y consiste en una mezcla compleja de colorantes ionizados, como la eosina (-) y el azul de metileno (+), los productos de oxidación del azul de metileno y los azures (+), mas los llamados colorantes neutors representados por los eosinatos no disociados del zul de metileno y los azures.




Técnicas para el estudio del Sistema Nervioso

La mayor parte de los tejidos animales puede ser estudiada empleando un solo tipo de coloración, por ejemplo la técnica clásica de hematoxilina y eosina. Este no es el caso del tejido nervioso, debido a la forma compleja de los tipos celulares que lo constituyen los cuales poseen prolongaciones delgadas y ramificadas, y debido a las complejas e íntimas relaciones estructurales de todos estos elementos celulares entres si. El análisis estructural de este tejido requiere en cambio la observación de preparaciones coloreadas con distintas técnicas, cada una de las cuales aporta información diferente y complementaria (localización y forma de los cuerpos neuronales, patrón espacial de distribución de las prolongaciones, distribución en el órgano de haces de fibras mielínicas, presencia de moléculas específicas, etc.).


Técnicas histoarquitecturales

Las técnicas histoarquitecturales son las técnicas que permiten la identificación de todos los cuerpos neuronales presentes en la sección y por lo tanto posibilitan un análisis anatómico del órgano considerado y la identificación de agrupamientos neuronales en núcleos o cortezas. Los métodos más usados para los estudios citoarquitectónicos son las tinciones como Hematoxilina-Eosina o Nissl con las cuales se tiñen todas las neuronas presentes en el tejido, obteniéndose información sobre el tamaño y grado de empaquetamiento de los somas neuronales en las distintas estructuras del sistema nervioso central. Cualquier estudio sobre una región determinada del SNC debe comenzar con un análisis citoarquitectónico de la región.


Hematoxilina - Eosina ↩︎


Tricrómico de Cajal-Gallego ↩︎


Técnica de Nissl

La técnica de Nissl se basa en la unión electrostática (salina) de anilinas básicas (en general se emplea azul de metileno, violeta de cresilo o azul de toluidina) con los componentes ácidos presentes en el tejido. Los componentes ácidos del tejido (ADN, ARN) se colorean en azul-violeta. Puede inducirse a veces el fenómeno de metacromasia (coloración final diferente al color del cromóforo empleado) por unión de moléculas del colorante, observando en este caso la aparición de un rosado púrpura intenso.




Técnicas mieloarquitecturales

Las técnicas colorean la mielina y permiten detectar la presencia y ubicación espacial de los haces de fibras mielínicas en los órganos del sistema nervioso.


Luxol Fast Blue y Klüver Barrera

El Luxol Fast Blue es un colorante que se fija al componente lipídico de la mielina y permite apreciar las fibras mielínicas en un celeste turquesa intenso. Los axones no se colorean. Esta coloración suele utilizarse esta coloración combinada con una anilina básica (técnica de Nissl). La combinación de ambas coloraciones recibe el nombre de técnica de Klüver-Barrera. La combinación de ambas tinciones permite identificar la distribución espacial de las neuronas en un órgano pero aportando además información sobre la disposición de las fibras mielínicas (es decir permite a la vez analizar la citoarquitectura y la mieloarquitectura).




Impregnación con tetróxido de osmio

Esta técnica se basa en la unión covalente del tetróxido de Osmio (OsO4) con lípidos insaturados (provocando su oxidación) con la formación de dióxido de osmio, el cual es de color negro. La vaina de mielina se colorea en negro por su alto contenido en lípidos insaturados. La técnica permite apreciar los distintos accidentes anatómicos de la vaina de mielina (nodos de Ranvier y cisuras de Schmidt-Lantermann). Los axones no se colorean.




Técnicas analíticas

Las técnicas analíticas son un grupo de técnicas histológicas clásicas para el estudio del SNC. Utilizan la impregnación metálica de los tejidos con sales de plata o de oro, lo cual permite contrastar la silueta de los elementos celulares en negro contra un fondo más pálido. Se observan las siluetas de los elementos celulares y permiten analizar la morfología y distribución de las prolongaciones celulares.


Impregnación argéntica de Golgi

La coloración con esta técnica se basa en la impregnación de algunos componentes tisulares con nitrato de plata previa incubación en dicromato de potasio. No se conocen con precisión los fundamentos de la reacción, por lo que se trata de una técnica empírica. Sólo se impregna un pequeño número de los elementos celulares presentes en el tejido.
Se observan las siluetas de las células impregnadas en negro sobre un fondo amarillo-dorado pálido. Sólo se impregna un pequeño número de células (2 a 5 %), pero las que se impregnan lo hacen en su totalidad por lo que puede apreciarse el detalle morfológico de las prolongaciones celulares. Se pueden obsevar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, mientras que la microglía no se detecta con esta técnica. Se observan también los vasos sanguíneos. Permite el análisis de los patrones de ramificación de las prolongaciones neuronales así como los accidentes anatómicos que pueden presentar (espinas, varicosidades).




Impregnación argéntica de Cajal para terminaciones nerviosas

El tejido se impregna con nitrato de plata, la cual se reduce y finalmente se realiza un viraje con una solución diluida de cloruro de oro. A causa del tratamiento químico durante el procesamiento del material, los filamentos intermedios neuronales (neurofilamentos) y los microtúbulos (neurotúbulos) se asocian artefactualmente entre si formando haces gruesos visibles al microscopio óptico, llamados clásicamente neurofibrillas. Se observan en marrón oscuro o negro sobre un fondo dorado.
Debido a la abundancia de neurofibrillas en los axones la técnica permite identificar estas prolongaciones y analizar su trayecto. En muchos casos es posible identificar las terminaciones axónicas presinápticas como pequeñas expansiones terminales. Algunos vasos aparecen impregnados de color marrón y en las neuronas de mayor tamaño pueden impregnarse en marrón pálido los núcleos.




Técnica de Del Río Hortega del carbonato de plata para microglía

Consiste en la impregnación del tejido con carbonato de plata lo cual permite la impregnación selectiva de las células microgliales.
Se observan las células microgliales impregnadas con la plata, en negro o violeta oscuro sobre un fondo más claro gris-violáceo. Algunos vasos sanguíneos y núcleos celulares también se impregnan. No se aprecian otros tipos celulares. La técnica permite analizar la morfología de las células microgliales.




Histoquímica

Las técnicas histoquímicas se denominan así porque permiten poner evidenciar la presencia específica de sustancias químicas o actividades enzimáticas en el tejido, preservando la estructura histológica del material.
La diferencia fundamental entre este tipo de técnicas y las tinciones de tipo citoarquitectural, es que con las técnicas histoquímicas se tiñen solamente aquellas células que presentan un determinado componente o una cierta actividad enzimática. Un determinado núcleo, definido citoarquitectónicamente con la técnica de Nissl, puede ser heterogéneo desde el punto de vista histoquímico.


Lectina de tomate (microglía)

Las lectinas son proteínas vegetales que tienen la capacidad de reconocer glúcidos con gran especificidad y fijarse a ellos con alta afinidad. En esta técnica se utiliza la lectina del tomate (Lycopersicum esculentum) la cual reconoce con gran afinidad los residuos glucídicos poli N-acetil lactosamina, que se expresan de modo específico en la membrana celular y el citoplasma de las células microgliales. La lectina utilizada en las preparaciones se encuentra unida a la enzima peroxidasa para permitir su detección mediante la producción de diaminobenzidina reducida (de color marrón oscuro). Se pueden observar células microgliales en marrón sobre fondo claro. Es importante destacar que las céluas endoteliales expresan el mismo glúcido en su membrana, por lo que también dan una reacción positiva, lo que hace esta técnica muy útil para estudiar la microvasculatura en el SNC.




NADPH diaforasa

La NADPH diaforasa pertenece al grupo de las deshidrogenasas, enzimas capaces de elimina hidrógeno de los sustratos y transferirlo a otra sustancia aceptora. La NADPH-diaforasa cataliza la deshidrogenación del NADPH. En la práctica, puede detectarse su actividad evidenciando la reducción del compuesto Nitro–Blue-Tetrazolium (NBT), dando lugar a un producto coloreado en azul violáceo oscuro (formazán).
Esta técnica histoquímica permite evidenciar las neuronas que presentan actividad NADPH diaforasa. Se ha demostrado en términos generales la presencia de esta enzima e neuronas capaces de sintetizar óxido nítrico y se utiliza para identificar la distribución de poblaciones neuronales específicas (que no pueden ser diferenciadas por la aplicación de técnicas citoarquitecturales comunes).




Inmunohistoquímica

Las técnicas inmunohistoquímicas permiten evidenciar la presencia de determinadas moléculas en el tejido mediante la utilización de anticuerpos específicos. Suele utilizarse para identificar específicamente ciertos tipos celulares del sistema nervioso. Por ejemplo, La proteína ácida glial fibrilar (GFAP) es un componente de los filamentos intermedios de los astrocitos. Su detección mediante anticuerpos específicos permite identificar con precisión este tipo celular en secciones de tejido nervioso. Lo mismo ocurre con Iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1) para marcar microglía.
La proteína de interés es reconocida por anticuerpos específicos. La fijación de los anticuerpos es detectada mediante la reacción con un anticuerpo secundario anti IgG de la especie en la que se generó el primario. Este anticuerpo secundario está por lo general asociado a fluorocromos (para su detección por microscopía de fluorescencia) o asociado a enzimas como la peroxidasa. En este último caso, se utiliza un sustrato de esta enzima (diamino bencidina, DAB) cuyo producto de reacción con el peróxido de hidrógeno da un precipitado de color marrón (DAB reducida). De esta forma se pueden apreciar las células detectadas por el anticuerpo primario coloreadas en marrón oscuro sobre fondo claro.





Microscopía de fluorescencia

La microscopía de fluorescencia, en sus distintas variedades (epifluorescencia, microscopía confocal, etc.) permite la observación de estructuras específicas en los tejidos gracias a la utilización de moléculas fluorescentes. Combinando fluorocromos con distinta longitud de onda de excitación y emisión, es posible identificar en forma simultánea y específica múltiples células o estructuras diferentes de interés, sin la interferencia del resto del tejido.


Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una variante de la inmunohistoquimica en la cual se utilizan anticuerpos acoplados a fluorocromos para la detección de las estructuras de interés.




Histofluorescencia

Bajo este término se engloban técnicas de microscopía de fluorescencia que no implican anticuerpos, ya sea reacciones químicas o la utilización de otras moléculas (ej. lectinas) acopladas a compuestos fluorescentes.




Microscopía electrónica

En las técnicas de microscopía electrónica se utiliza un haz de electrones en lugar de luz para la observación de la muestra y generar una imagen. Esto permite conseguir un poder de reolución significativamente mayor que el de la microscopía óptica, lo que permite el estudio de la ultraestructura celular.


Microscopía electrónica de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión utiliza un haz de electrones que atraviesa la muestra (cortada con ultramicrótomo y procesada con metales pesados) y es captado por un detector. Las partes de la muestra que han sido atravesadas por los electrones aparecen claras (electronlúcidas); las zonas oscuras (electrondensas) de la muestra son las que han absorbido o dispersado los electrones debido a su densidad inherente o debido a la adición de metales pesados durante la preparación. Esta técnica permite apreciar en gran detalle las estructuras internas de la célula.




Microscopía electrónica de barrido

La microscopía electrónica de barrido (scanning) permite la observación de los detalles en las superficies celulares. La muestra no se corta en ultramicrótomo, sino que para su observación se debe recubrir con una capa delgada de metales pesados y posteriormente se utiliza un haz de electrones para "barrer" la superficie, registrando los electrones a medida que son reflejados y dispersados sobre la muestra.

 

Microscopio Virtual - Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay
Construcción y mantenimiento del Microscopio Virtual: Ernesto Miquel
Procesamiento, corte y coloración de la mayoría de los preparados histológicos: Técnicas Graciela Trifoglio, Ana Paula Leites y Karina Hernández
Edición de textos descriptivos: Julio Siciliano, Gabriel Anesetti, Laura Martínez, Ernesto Miquel

Preguntas, reporte de errores, comentarios o sugerencias: miquel@fmed.edu.uy

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